腸道微生物群涉及復(fù)雜的代謝相互作用，包括分解和再利用宿主和飲食來源的營養(yǎng)物質(zhì)。對(duì)這些資源的競爭可以限制病原體的生長。然而，一些腸道病原菌可以通過目前尚不清楚的機(jī)制侵入這一生態(tài)位。利用沙門氏菌腹瀉的小鼠模型和轉(zhuǎn)座子突變體篩選，我們發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella Typhimurium,S.Tm）在未受干擾的腸道中的初始生長是由S.Tm的hyb氫化酶(hyb hydrogenase)驅(qū)動(dòng)的，該酶促進(jìn)消耗氫氣（H?）——這是微生物群代謝的一個(gè)核心中間產(chǎn)物。在競爭性感染實(shí)驗(yàn)中，與野生型S.Tm相比，hyb突變體在感染早期表現(xiàn)出生長缺陷（約降低100倍；p<0.05）。但在抗生素介導(dǎo)的宿主微生物群破壞后，這些差異消失。此外，將耗氫菌引入微生物群會(huì)干擾依賴hyb的S.Tm生長。因此，H?是微生物群代謝的一個(gè)阿喀琉斯之踵(Achilles'heel)，可被病原體利用，并可能為預(yù)防感染提供機(jī)會(huì)。

哺乳動(dòng)物的腸道內(nèi)密集定殖著微生物，統(tǒng)稱為微生物群。微生物群具有一個(gè)代謝活動(dòng)網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)將復(fù)雜的飲食和宿主來源的碳水化合物高效分解為短鏈脂肪酸（SCFAs）、氫氣（H?）和二氧化碳。微生物發(fā)酵產(chǎn)物隨后被交叉喂養(yǎng)的次級(jí)發(fā)酵菌消耗、被宿主吸收或釋放到環(huán)境中。腸道生態(tài)系統(tǒng)入侵(Gut ecosystem invasion)在本文中定義為病原體（或任何其他新來者）在宿主腸道中的初始生長階段。在此階段，腸道黏膜看起來健康，微生物群（仍然）完整，并限制了營養(yǎng)可用性。這阻止了大多數(shù)新到達(dá)細(xì)菌的生長。盡管營養(yǎng)可用性稀缺，腸道病原體仍能入侵腸道生態(tài)系統(tǒng)。然而，使腸道病原體能夠“入侵腸道生態(tài)系統(tǒng)”的機(jī)制在很大程度上仍不清楚。

人類食源性病原體鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella Typhimurium,S.Tm）是腹瀉的病原體，可以在這種營養(yǎng)耗竭的環(huán)境中生長到高數(shù)量并引發(fā)疾病。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，腸道管腔內(nèi)的病原體密度必須達(dá)到每克糞便10?-10?菌落形成單位（cfu）才會(huì)引發(fā)腸病。由于低至103-10?細(xì)菌的接種量足以在人類中引起腹瀉疾病，我們推測S.Tm可以在面對(duì)完整的微生物群和健康的腸道時(shí)進(jìn)行初始生長。S.Tm在這個(gè)密集定殖的生態(tài)位中生長的機(jī)制仍然是個(gè)謎。這種機(jī)制可以使用“低復(fù)雜度微生物群”（low complex microbiota,LCM）小鼠進(jìn)行研究，這種小鼠允許S.Tm在腸道管腔內(nèi)生長。LCM小鼠是前無菌小鼠，最初被接種了“改變的沙德勒菌群”的菌株，并允許小至200個(gè)菌落形成單位（cfu）的接種量在腸道管腔內(nèi)定殖。在感染后的頭2天內(nèi)，沒有腸病的跡象，病原體生長到每克糞便10?-10?cfu（腸道生態(tài)系統(tǒng)入侵）。當(dāng)病原體達(dá)到每克糞便10?-101?cfu的最終密度時(shí)，在感染后第3-4天引發(fā)黏膜炎癥。因此，LCM小鼠為分析宿主腸道定殖的所有階段（包括腸道生態(tài)系統(tǒng)入侵）提供了一個(gè)獨(dú)特的模型。

Unisense氫氣微電極系統(tǒng)的應(yīng)用

Unisense微電極被用于測量小鼠盲腸腔內(nèi)的氫氣（H?）濃度，使用了Unisense氫氣微電極（H?-50），其尖端直徑為50微米。處死小鼠后，取盲腸及回腸、大腸，固定于含2%瓊脂的培養(yǎng)皿底層，并覆蓋45°C的2%瓊脂頂層以固定組織。使用26號(hào)針頭在組織上打孔，以便微電極尖端能夠穿透盲腸腔在每個(gè)盲腸中，使用氫氣微電極分別在盲腸尖端、中段和與小腸、大腸連接處測量了三個(gè)不同位置的氫氣濃度。氫氣微電極測量不同小鼠模型（包括無菌小鼠、低復(fù)雜微生物群小鼠和傳統(tǒng)小鼠）盲腸中的氫氣濃度，發(fā)現(xiàn)只有存在微生物群的小鼠盲腸中存在高水平的氫氣，而無菌小鼠的盲腸中未檢測到氫氣。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

鼠傷寒沙門氏菌（S.Tm）在腸道生態(tài)系統(tǒng)入侵的初始階段依賴于其hyb氫化酶來利用氫氣（H?）。氫氣是腸道微生物群代謝的產(chǎn)物，S.Tm通過消耗氫氣獲得能量，從而在腸道微生物群的密集定殖環(huán)境中獲得生長優(yōu)勢。實(shí)驗(yàn)表明，S.Tm的hyb氫化酶僅在感染的前24小時(shí)內(nèi)（即腸道生態(tài)系統(tǒng)入侵的初始階段）是必需的。在這個(gè)階段，S.Tm利用氫氣作為能量來源，能夠在未受干擾的腸道微生物群中生長。而在感染后期，當(dāng)腸道炎癥被觸發(fā)后，氫氣的利用不再對(duì)S.Tm的生長起關(guān)鍵作用。通過引入消耗氫氣的細(xì)菌，可以干擾依賴hyb的S.Tm生長，這表明氫氣是微生物群代謝的一個(gè)潛在弱點(diǎn)，可能被病原體利用，也可能為預(yù)防感染提供機(jī)會(huì)。通過對(duì)不同宿主的微生物群基因組分析，發(fā)現(xiàn)幾乎所有可用的腸道微生物群基因組都顯示出氫氣生成途徑的證據(jù)，表明氫氣的利用可能是腸道病原體入侵的一個(gè)普遍策略。

圖1.hyb-氫化酶突變體在腸道生態(tài)系統(tǒng)入侵中表現(xiàn)出缺陷。(A)將hyb-氫化酶突變體與氫化酶正常的同源菌株S.TmWT按1:1比例混合（5×10?cfu，經(jīng)灌胃），并感染五只天真的LCM小鼠。通過平板計(jì)數(shù)測定糞便中兩種菌株的負(fù)荷，并計(jì)算競爭指數(shù)（C.I.）。(B)Lipocalin-2 ELISA監(jiān)測實(shí)驗(yàn)期間的炎癥發(fā)生。箱線圖表示第一四分位數(shù)和第三四分位數(shù)，須表示最小值和最大值。

圖2、S.Tm僅在非炎癥早期階段從H2中獲益。(A)在五只LCM小鼠中進(jìn)行競爭指數(shù)實(shí)驗(yàn)，檢測S.Tmavir hyd3在體內(nèi)的適應(yīng)性。ns表示不顯著（p≥0.05），**表示p<0.01，Mann-Whitney U檢驗(yàn)。(B)第4天p.i.盲腸組織病理評(píng)分，對(duì)組織進(jìn)行HE染色并評(píng)估炎癥情況。(C)第1天和第4天分別通過平板計(jì)數(shù)測定S.Tmavir hyd3和S.Tmavir的糞便載量。*p<0.05，配對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單側(cè)Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)（虛線表示配對(duì)關(guān)系）。

圖3、S.Tm氫化酶突變體在腸道入侵缺陷與微生物產(chǎn)生的H2有關(guān)。(A)測定盲腸腔中H?濃度，在三個(gè)不同位置進(jìn)行測量，并修正H?S的電極交叉敏感性（每組3只小鼠）。(B)在五只無菌小鼠中進(jìn)行S.Tmavir hyd3與S.Tmavir的C.I.實(shí)驗(yàn)（5×10?cfu，灌胃，第1天p.i.分析）。(C)在天真的LCM小鼠或鏈霉素預(yù)處理小鼠中進(jìn)行S.Tmhyd3與S.TmWT的C.I.實(shí)驗(yàn)（每組10/5只小鼠，第1天p.i.分析）。(D)在天真的CON小鼠或鏈霉素處理小鼠中進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)（每組5只小鼠）。(E)第1天p.i.的盲腸組織病理評(píng)分。(F)第1天p.i.對(duì)競爭菌株的負(fù)荷進(jìn)行平板計(jì)數(shù)分析。

圖4、S.Tmavir hyd3在天真的LCM和CON小鼠中定植能力受損。(A)八只天真的LCM小鼠或(B)七只天真的CON小鼠分別感染S.Tmavir或S.Tmavir hyd3（5×10?cfu，灌胃），在第1天p.i.測定糞便載量。

圖5、引入氫氣消耗者干擾S.Tm通過hyb途徑的腸道入侵。(A)實(shí)驗(yàn)策略。(B)LCM小鼠預(yù)先定殖氫氣消耗菌株S.Tmavir（實(shí)驗(yàn)組）或不能消耗氫氣的突變體S.Tmavir hyd3（對(duì)照組）（5×10?cfu，灌胃，提前1天）。通過平板計(jì)數(shù)確認(rèn)定殖效果。隨后用S.Tmavir與S.Tmavir hyd3按1:1比例混合（5×10?cfu，灌胃）再次感染（每組5只小鼠），第1天p.i.測定競爭指數(shù)。

結(jié)論與展望

本研究利用小鼠沙門氏菌腹瀉模型和轉(zhuǎn)座子突變體篩選，發(fā)現(xiàn)沙門氏菌Typhimurium（S.Tm）在未擾動(dòng)的腸道中的初期生長依賴于其hyb氫化酶，該酶能促進(jìn)氫氣（H?）的利用，而氫氣正是腸道菌群代謝中的核心中間產(chǎn)物。在競爭性感染實(shí)驗(yàn)中，與野生型S.Tm相比，hyb突變株在感染早期的生長顯著受限，但當(dāng)抗生素破壞宿主菌群后，這一差異消失。此外向腸道菌群中引入消耗氫氣的細(xì)菌也會(huì)干擾hyb依賴的S.Tm生長。因此，氫氣作為腸道菌群代謝的“阿喀琉斯之踵”可以被病原體利用，同時(shí)也可能成為預(yù)防感染的新靶點(diǎn)。Unisense微電極被用于測量小鼠盲腸腔內(nèi)的氫氣（H?）濃度，以驗(yàn)證微生物群產(chǎn)生的氫氣是否為鼠傷寒沙門氏菌（S.Tm）入侵腸道生態(tài)系統(tǒng)提供能量支持。研究人員通過unisense氫氣微電極高精度的氫氣濃度測量，為理解腸道微生物群與病原體之間的代謝相互作用提供了直接的證據(jù)。本研究揭示了氫氣在鼠傷寒沙門氏菌入侵腸道生態(tài)系統(tǒng)中的關(guān)鍵作用，并指出氫氣是腸道微生物群代謝的一個(gè)潛在弱點(diǎn)，可能被病原體利用。通過調(diào)節(jié)氫氣的可用性，可以為預(yù)防腸道病原體感染提供新的策略。