研究簡(jiǎn)介:Methanococcus maripaludis是一種嗜溫產(chǎn)甲烷菌，能夠利用氫氣（H?）或甲酸鹽（formate）將二氧化碳（CO?）還原為甲烷（CH?）以獲取能量。這種菌在鹽沼沉積物中很常見(jiàn)，具有多種氫化酶，這些酶在氫氣代謝中起重要作用。由于氫氣是一種清潔且高效的能源，研究人員希望探索這種產(chǎn)甲烷菌利用甲酸鹽產(chǎn)生氫氣的潛力，以期為生物制氫提供新的思路。以甲酸鹽或H2生長(zhǎng)的靜息細(xì)胞的比活性為0.4至1.4 U·mg-1(干重)。甲酸鹽生長(zhǎng)的細(xì)胞中H2生產(chǎn)遵循米氏動(dòng)力學(xué)，甲酸鹽的半最大活性濃度(Kf)為3.6 mM。相比之下，H2生長(zhǎng)的細(xì)胞中此過(guò)程遵循S型動(dòng)力學(xué)，Kf為9 mM。甲酸鹽依賴的H2生產(chǎn)的關(guān)鍵酶是甲酸脫氫酶Fdh。在缺失編碼Fdh1同工酶的基因的突變體中，H2生產(chǎn)和生長(zhǎng)嚴(yán)重減少，表明Fdh1是主要的甲酸脫氫酶。相反缺失編碼Fdh2同工酶的基因的突變體具有接近野生型的活性，表明該同工酶不起主要作用。缺失輔酶F420還原氫化酶Fru的突變體的H2生產(chǎn)也嚴(yán)重減少，表明主要的H2生產(chǎn)途徑由Fdh1和Fru組成。由于Δfru-Δfrc突變體保留了10%的野生型活性，因此還存在另一條途徑。缺失編碼F420依賴的亞甲基-H4 MTP脫氫酶(Mtd)或H2形成的亞甲基-H4 MTP脫氫酶(Hmd)的突變體活性也降低，表明第二條途徑由Fdh1-Mtd-Hmd組成。與H2生產(chǎn)不同，這些突變體中甲烷生成的細(xì)胞速率未受影響，表明觀察到的H2生產(chǎn)并非甲烷生成的直接中間產(chǎn)物。甲酸鹽依賴的高速率H2生產(chǎn)展示了M.maripaludis從甲酸鹽微生物生產(chǎn)H2的潛力。

Unisense氫氣微電極系統(tǒng)的應(yīng)用

Unisense微電極被用于精確測(cè)量Methanococcus maripaludis在厭氧條件下從甲酸鹽產(chǎn)生氫氣（H?）的濃度和速率。將細(xì)胞懸浮液加入到含有Unisense微電極的反應(yīng)比色皿中，通過(guò)改良的安培式氧氣克拉克型電極連接到Unisense picoammeter PA2000，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)溶解氫氣的濃度。通過(guò)對(duì)Unisense微電極測(cè)量數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，M.maripaludis在最初的1分鐘內(nèi)從甲酸鹽產(chǎn)生氫氣的速率呈線性增長(zhǎng)，隨后速率下降直至達(dá)到平衡。氫氣產(chǎn)生的最大濃度在0.4到0.8 mM之間，接近理論平衡濃度3 mM。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

M.maripaludis能夠高效地從甲酸鹽產(chǎn)生氫氣，其產(chǎn)氫速率在不同生長(zhǎng)條件下表現(xiàn)出顯著差異。在最佳條件下，產(chǎn)氫速率可達(dá)1.4 U/mg（干重），這在已知的微生物中屬于較高水平。氫氣產(chǎn)生的速率和動(dòng)力學(xué)特性受到生長(zhǎng)條件的顯著影響，尤其是氫氣的可用性。在氫氣限制條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的產(chǎn)氫活性。通過(guò)基因敲除實(shí)驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)Fdh1是甲酸鹽依賴性氫氣產(chǎn)生的主要酶，而Fdh2的作用較小。Fdh1缺失的突變株在甲酸鹽利用和氫氣產(chǎn)生方面表現(xiàn)出嚴(yán)重缺陷，而Fdh2缺失的突變株則接近野生型水平。甲酸鹽依賴的氫氣產(chǎn)生遵循米氏動(dòng)力學(xué)（Michaelis-Menten kinetics），其半飽和常數(shù)（Kf）為3.6 mM，表明Fdh1對(duì)甲酸鹽的親和力較高。氫氣產(chǎn)生的速率與甲烷生成的速率相當(dāng)，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氫氣并非甲烷生成過(guò)程中的必需中間體。在某些突變株中，氫氣產(chǎn)生顯著減少，但甲烷生成并未受到顯著影響。這表明M.maripaludis在甲酸鹽代謝中可能存在其他電子傳遞途徑，氫氣的產(chǎn)生可能是代謝過(guò)程中的副產(chǎn)物。

圖1、氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌中H2合成的潛在途徑。第一條途徑包含F(xiàn)dh和Fru。在該途徑中，F(xiàn)dh還原F420。在含硒培養(yǎng)的細(xì)胞中，F(xiàn)420H2被[Ni-Fe]氫化酶Fru氧化。第二條途徑中，F(xiàn)420H2被Mtd氧化，將亞甲基-H4MPT還原為亞甲基-H4MPT，隨后被不含鎳的氫化酶Hmd重新氧化產(chǎn)生H2。

圖2、M.maripaludis靜息細(xì)胞從甲酸鹽產(chǎn)生H2的初始速率(實(shí)線)。細(xì)胞以甲酸鹽培養(yǎng)，經(jīng)緩沖液洗滌后重懸于反應(yīng)比色皿中。通過(guò)添加20 mM甲酸鈉(箭頭)啟動(dòng)反應(yīng)。虛線顯示未添加甲酸鹽的細(xì)胞懸浮液孵育結(jié)果。

圖3、H2限制條件下生長(zhǎng)的靜息細(xì)胞甲酸鹽依賴H2生產(chǎn)的變化。野生型S2在1升Wheaton瓶中用100 ml肉湯培養(yǎng)，分別使用基本培養(yǎng)基McNA(○)和豐富培養(yǎng)基McCV(●)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，瓶子用138 kPa H2-CO2(80:20[體積比])加壓。在不同吸光度時(shí)采集細(xì)胞樣品(20 ml)，如插圖中生長(zhǎng)曲線上的點(diǎn)所示。每次取樣后，瓶子用N2-CO2(80:20[體積比])重新加壓。這導(dǎo)致H2限制但維持CO2濃度。

圖4、野生型和fdh突變株在H2或甲酸鹽條件下的生長(zhǎng)情況。實(shí)心符號(hào)表示H2(276 kPa；H2-CO2 80:20[體積比])條件下的生長(zhǎng)；空心符號(hào)表示甲酸鹽(100 mM)條件下的生長(zhǎng)。圓形代表S2；倒三角形代表ΔfdhA1；方形代表ΔfdhA2；菱形代表ΔfdhA1-ΔfdhA2。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。

圖5、野生型菌株S2靜息細(xì)胞的甲酸鹽依賴性H2生產(chǎn)動(dòng)力學(xué)，該菌株先前分別在H2(A)或甲酸鹽(B)條件下培養(yǎng)。ΔfdhA2突變體的動(dòng)力學(xué)如插圖所示。S2和ΔfdhA2突變株分別培養(yǎng)至吸光度約0.8和0.6。

結(jié)論與展望

本論文研究了嗜溫產(chǎn)甲烷菌Methanococcus maripaludis利用甲酸鹽（formate）產(chǎn)生氫氣（H?）的特性及其潛在應(yīng)用。M.maripaludis是一種能夠利用氫氣或甲酸鹽將二氧化碳還原為甲烷的產(chǎn)甲烷菌，其在鹽沼沉積物中廣泛存在，并且具有多種氫化酶，這些酶在氫氣代謝中起重要作用。本研究旨在探索這種菌利用甲酸鹽產(chǎn)生氫氣的能力，為生物制氫提供新的思路。研究人員使用了M.maripaludis的野生型菌株S2及其突變株。菌株在含有甲酸鹽或氫氣的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)中還使用了不同的培養(yǎng)基成分和氣體壓力條件。通過(guò)定制的厭氧水浴比色皿和改良的安培式氧氣克拉克電極（unisense）測(cè)量溶解氫氣的濃度，同時(shí)通過(guò)氣相色譜法檢測(cè)甲烷的產(chǎn)生。此外研究還制備了細(xì)胞提取物，并通過(guò)光譜法測(cè)定甲酸脫氫酶（Fdh）和F420還原氫化酶的活性。Unisense微電極在本研究中被用于精確測(cè)量Methanococcus maripaludis在厭氧條件下從甲酸鹽產(chǎn)生氫氣（H?）的濃度和速率。通過(guò)分析unisense精確測(cè)量氫氣的產(chǎn)生速率和濃度，為研究M.maripaludis的氫氣代謝機(jī)制提供了關(guān)鍵數(shù)據(jù),。本論文深入探討了M.maripaludis在生物制氫方面的潛力，還揭示了其氫氣產(chǎn)生機(jī)制，為未來(lái)開(kāi)發(fā)高效的生物制氫系統(tǒng)提供了重要的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。