材料與方法：

實驗程序：

組織恢復(fù)方法獲得了新西蘭懷卡托大學(xué)動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

藻類培養(yǎng)：

衣藻（野生型1690）在250mL的棉塞Duran玻璃瓶中用100mL磷酸三乙酸酯（TAP）培養(yǎng)基培養(yǎng)7-10天，接種自在含瓊脂15g/L的滅菌固體TAP培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落。液體培養(yǎng)基建立后，每周用100毫升TAP培養(yǎng)基補(bǔ)充10毫升藻類懸浮液。培養(yǎng)條件為室溫（20.5±0.5°C），使用磁力攪拌器（250rpm）或通氣（300mL/min）持續(xù)攪拌。恒定光源位于培養(yǎng)容器上方20厘米處。

氧氣測量：

溶解氧濃度（毫克/升）是使用克拉克型氧電極（尖端直徑25微米）（丹麥Unisense有限公司）測量的，該電極與單通道微傳感器裝置相連，并以5赫茲的速率采樣。每天開始時對電極進(jìn)行極化，以獲得穩(wěn)定的輸出。在與室內(nèi)空氣平衡的溶液和0.1M抗壞血酸鈉（零點(diǎn)）中進(jìn)行兩點(diǎn)校準(zhǔn)。

衣藻培養(yǎng)的氧氣產(chǎn)量：

皮層腦組織在體外人工腦脊液（aCSF）中保存，這種鹽培養(yǎng)基的成分與用于培養(yǎng)衣藻的TAP培養(yǎng)基有很大不同。因此，有必要確認(rèn)懸浮在人工腦脊液中的藻類培養(yǎng)物是有生命力的，并且能夠產(chǎn)生可能支持大腦皮層新陳代謝的氧氣。

無鎂無碳酸鹽層中的氧氣產(chǎn)生量（n=5）：

將TAP培養(yǎng)基中的藻類懸浮液（30mL）轉(zhuǎn)移到10mL管中，并通過離心（4,400rpm，8分鐘）將細(xì)胞與TAP培養(yǎng)基分離。除去TAP培養(yǎng)基上清液，將細(xì)胞重懸于不含鎂離子的30mL室內(nèi)平衡aCSF中。從無鎂腦脊液中去除鎂離子可支持大腦皮層切片組織的網(wǎng)絡(luò)活動的大腦皮層切片實驗。無鎂aCSF由124mM NaCl、5mM KCl、2mM CaCl2、1.25mM NaH2PO4、2.5mM NaHCO3、10mM HEPES和10mM D-葡萄糖組成。LED光源位于樣品上方10厘米處，測量值為燈泡底部到容器中部的垂直距離。樣品處的光強(qiáng)（LUX）測量值為310μmol/m2。在室溫（20.5±0.5?C）條件下，持續(xù)光照90分鐘，在培養(yǎng)基表面下約3毫米處測量氧氣含量。定期輕輕攪拌培養(yǎng)物，以防止藻類沉淀。

干重電池質(zhì)量：

產(chǎn)氧測試結(jié)束后，對部分樣本（n=4）的藻類干重（DW）進(jìn)行量化。將樣品轉(zhuǎn)移到預(yù)先稱重的10毫升試管中，以每分鐘4,400轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，直至上清液變清。小心去除上清液，將細(xì)胞物質(zhì)留在試管底部。將試管放入約100?C的對流烘箱中烘干60分鐘。重新稱量試管，得出細(xì)胞材料的干重。

皮層切片制備，組織解剖和制備：

皮質(zhì)切片按照常規(guī)方法制備。簡單地說，用二氧化碳麻醉成年雄性或雌性C57小鼠，迅速解剖大腦并將其浸沒在由125mM NaCl、2.5mM KCl、1mM MgCl2、2mM CaCl2、1.25mM NaH2PO4、2.5mM NaHCO3、10mM HEPES和10mM D-葡萄糖組成的冰冷"正常"aCSF中。使用振動切片機(jī)將大腦冠狀切成Bregma1至5之間400μm厚的切片。隨后，在室溫（約21?C）下將切片浸入無鎂aCSF中至少60分鐘。所有溶液都通過95%氧氣（氮?dú)馄胶猓┑?傳統(tǒng)"氣泡充氧。

皮層切片制備，癲癇樣事件(SLE)活動的組織記錄：

組織制備完成后，切片被轉(zhuǎn)移到灌注記錄槽中，并浸沒在無鎂無碳酸鹽溶液中。將大腦皮層切片暴露在無鎂的無碳酸鹽溶液中，可通過解除對NMDA受體的阻斷來激活組織，從而產(chǎn)生重復(fù)的、自發(fā)的陣發(fā)性事件，即癲癇發(fā)作樣事件（SLEs）。所有皮層和區(qū)域均可記錄SLE，它反映了興奮性和抑制性神經(jīng)元混合群的協(xié)調(diào)發(fā)射。SLE參數(shù)可用作組織代謝狀態(tài)和存活率的指南，本研究利用這些參數(shù)來確定藻類培養(yǎng)物是否能支持無血管皮層組織中的能量網(wǎng)絡(luò)活動。特別是，SLEs數(shù)量（頻率）和大小（振幅和長度）的減少反映了組織受到新陳代謝的挑戰(zhàn)。

皮層系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動是通過一個75微米的Ag/AgCl電極在細(xì)胞外記錄的。在記錄槽中與切片相距較遠(yuǎn)的一個圓盤銀/氯化銀電極被用作共同參考/接地。模擬信號被放大1000倍，并轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號，用于后期分析。模擬信號經(jīng)過以下濾波：高通∥1Hz，低通∥300Hz，陷波濾波器為50Hz，采樣率為1000s∥1。

皮層切片實驗方案1：急性（30分鐘）海藻暴露：

這組實驗的目的是確定在以光合作用為唯一氧氣補(bǔ)充來源的藻類環(huán)境中，大腦皮層網(wǎng)絡(luò)動態(tài)是否能夠得到支持。

將皮層切片轉(zhuǎn)移到浸沒式灌注浴中。在灌注（5mL/min）無鎂aCSF的同時，在每個切片的單個皮層位置建立系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動基線，該aCSF通過氣泡式95%氧氣和平衡氮進(jìn)行常規(guī)充氧。灌注是通過重力從位于灌注浴上方60厘米處的貯水池中輸入的。在建立穩(wěn)定的基線SLE活性后，對無鎂aCSF（如上所述制備）中的藻類懸浮液灌注約30分鐘（n=9）。灌注浴用10WLED燈點(diǎn)亮，LED燈略微傾斜，高出灌注浴10厘米。升高的培養(yǎng)槽用一個14W的LED燈點(diǎn)亮，該LED燈位于培養(yǎng)槽容器上方10厘米處。培養(yǎng)液未進(jìn)行外部充氧。然后用未充氧（室內(nèi)平衡）的無鎂aCSF向浴槽灌注約20分鐘，然后再回到常規(guī)充氧的無鎂aCSF。有三次，每次灌注一個切片；有兩次，同時灌注三個切片，每個切片只有一個記錄位置。在一次試驗中，藻類培養(yǎng)液換成了灌注的含氧無鎂腦脊液，并完全重復(fù)了無氧無鎂腦脊液的試驗方案（使用相同的切片和記錄位置）。

在另一組實驗中（n=6），切片在基線記錄后暴露于"脫氧"的無鎂aCSF中。為了使氧氣濃度低于未缺氧的室溫平衡aCSF，在加入aCSF鹽之前，先將蒸餾水煮沸4-5分鐘，然后將其置于無空氣的密閉容器中，冷卻至室溫（使aCSF的氧氣水平達(dá)到1-2mg/L）。

這些方案提供了四種腦脊液充氧條件，用于比較對系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動的影響：常規(guī)充氧（用95%的氧氣鼓泡）；光合藻類充氧；不充氧（室內(nèi)平衡）和脫氧。假設(shè)沒有急性毒性，我們的假設(shè)是，在暴露于藻類期間，大腦皮層的動態(tài)將保持不變，但當(dāng)室內(nèi)平衡和脫氧aCSF中的氧含量降低時，大腦皮層的動態(tài)將受到明顯抑制。

作為對照，將切片（n=6）暴露于未吸氧的aCSF中，同時照亮或不照亮aCSF儲庫和切片灌注浴。

皮層切片實驗方案2：組織和aCSF氧合：

這組實驗的目的是量化不同充氧條件下腦脊液和大腦皮層組織中的氧含量：常規(guī)充氧（n=12）；光合藻類充氧（n=7）；無充氧（n=12）。

由于浸沒皮層切片實驗中的氧濃度隨aCSF深度變化很大，因此要生成從aCSF表面到切片中部的氧曲線。根據(jù)上述實驗條件將皮層切片置于灌注浴中，使用精密微型機(jī)械手電極以150微米的步長前進(jìn)，直到尖端停留在切片表面，然后以100微米的步長進(jìn)入皮層III-IV層，深度約為300微米。每前進(jìn)一步，先讓氧氣水平穩(wěn)定下來，然后再讀取讀數(shù)并進(jìn)行下一步調(diào)整。氧信號以5Hz的采樣率連續(xù)記錄。

皮層切片實驗方案3：長時間（5小時）接觸藻類：

這組實驗的目的是確定長期接觸海藻是否會對大腦皮層神經(jīng)生理學(xué)產(chǎn)生毒性影響。

按上述方法制備一只動物的切片（n=6）。將每只動物的三片切片分別放入裝有無鎂aCSF和無鎂aCSF中藻類培養(yǎng)液的靜態(tài)室（約200mL）中。為防止藻類沉淀，兩個室都用室內(nèi)空氣充氣，充氣量約為300mL/min。兩個培養(yǎng)室都沒有進(jìn)行外部充氧。藻類室從上方用14瓦的白色發(fā)光二極管照明，距離5-10厘米。定期測量藻室中的氧氣含量。

將每片切片從試驗室中取出，在記錄槽中灌注（5mL/min）無鎂aCSF。記錄六個位置，每個半球三個，大致等距。每個位置至少記錄五個SLE。如果在3分鐘內(nèi)沒有SLE或在10分鐘內(nèi)SLE少于5個，則認(rèn)為該部位處于非活動狀態(tài)。2小時測試后，將切片放回各自的腔室，5小時后再次測試。

數(shù)據(jù)分析：

切片性能通過量化三個SLE參數(shù)來評估：長度、振幅和事件頻率。缺氧導(dǎo)致的組織功能衰退表現(xiàn)為SLE更小、頻率更低。長度和振幅按四個連續(xù)事件的平均值計算。根據(jù)原始記錄量化2分鐘內(nèi)的SLE頻率。通過計算50秒窗口內(nèi)原始波形的平均絕對電壓來量化組織活動的整體度量，事件間期歸一化為零。這實際上給出了電壓波形下的平均面積，將SLE振幅、頻率和長度整合為一個單一指標(biāo)，我們稱之為"整體"活動。

采用重復(fù)測量方差分析（正態(tài)分布數(shù)據(jù)）和弗里德曼檢驗（非正態(tài)分布數(shù)據(jù)）對多組比較的系統(tǒng)性紅斑狼瘡參數(shù)進(jìn)行檢驗。配對比較采用Wilcoxon檢驗（正態(tài)分布數(shù)據(jù)）和配對t檢驗（非正態(tài)分布數(shù)據(jù)）。p值小于0.05即為具有統(tǒng)計學(xué)意義。